W dziedzinie współczesnej mikroskopii i obrazowania techniki fluorescencyjne okazały się potężnymi narzędziami do wizualizacji struktur i procesów biologicznych na poziomie komórkowym i molekularnym. Szczególnie obrazowanie metodą fluorescencji dwufotonowej zyskało znaczną popularność ze względu na swoje unikalne zalety, takie jak głębsza penetracja tkanek, zmniejszona fototoksyczność i poprawiona rozdzielczość trójwymiarowa. Z drugiej strony fluorescencyjne skanery slajdów są szeroko stosowane do wysokowydajnego obrazowania skrawków tkanek i próbek komórek. Jako dostawca fluorescencyjnych skanerów do slajdów często spotykamy się z pytaniem: Czy fluorescencyjny skaner do slajdów może być używany do obrazowania fluorescencyjnego dwufotonowego?
Zrozumienie fluorescencyjnych skanerów slajdów
Fluorescencyjne skanery slajdów są przeznaczone do przechwytywania obrazów o wysokiej rozdzielczości próbek oznakowanych fluorescencyjnie na szkiełkach. Zwykle składają się ze stolika do utrzymywania szkiełka, źródła światła do wzbudzenia, systemu detekcji fluorescencji i zmotoryzowanego mechanizmu skanującego. Źródłem światła może być lampa rtęciowa, lampa metalohalogenkowa lub, ostatnio, diody elektroluminescencyjne (LED). System detekcji zwykle zawiera zestaw filtrów do wyboru odpowiednich długości fali wzbudzenia i emisji oraz kamerę o wysokiej czułości do przechwytywania sygnałów fluorescencyjnych.
Nasza firma oferuje szeroką gamę skanerów fluorescencyjnych do slajdów, m.inCyfrowy skaner patologiczny GScan - 60,Skaner slajdów Brightfield EScan - 1200, ICyfrowy skaner slajdów patologicznych. Skanery te są znane ze swoich możliwości skanowania o wysokiej precyzji, przyjaznych dla użytkownika interfejsów i doskonałej jakości obrazu. Nadają się do różnych zastosowań, takich jak histologia, cytologia i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH).
Zasada dwójki – obrazowanie fluorescencji fotonowej
Obrazowanie fluorescencji dwufotonowej opiera się na zasadzie absorpcji dwufotonowej. W konwencjonalnym procesie fluorescencji fotonowej fluorofor absorbuje pojedynczy foton o odpowiedniej energii, a następnie emituje foton o niższej energii (dłuższa długość fali). W absorpcji dwufotonowej fluorofor absorbuje jednocześnie dwa fotony, każdy z około połową energii potrzebnej do wzbudzenia jednego fotonu. Proces ten wymaga wysokiej intensywności, krótkoimpulsowej wiązki lasera, zazwyczaj lasera tytanowo-szafirowego.
Kluczową zaletą obrazowania fluorescencyjnego dwufotonowego jest jego zdolność do osiągnięcia głębokiej penetracji tkanek. Ponieważ absorpcja dwufotonowa zachodzi tylko w ognisku wiązki laserowej, gdzie gęstość fotonów jest duża, wzbudzenie ogranicza się do małej objętości próbki. Zmniejsza to fluorescencję tła i fotowybielanie poza płaszczyzną ogniskową, umożliwiając obrazowanie o wysokiej rozdzielczości grubych próbek tkanek.
Czy fluorescencyjny skaner slajdów może być używany dla dwojga - obrazowanie fluorescencji fotonowej?
Ogólnie rzecz biorąc, tradycyjny skaner fluorescencyjny do slajdów nie jest przeznaczony do obrazowania fluorescencyjnego dwufotonowego i jest ku temu kilka powodów:
1. Źródło światła
Jak wspomniano wcześniej, obrazowanie fluorescencji dwufotonowej wymaga źródła laserowego o dużej intensywności i krótkich impulsach. Większość fluorescencyjnych skanerów slajdów wykorzystuje źródła światła o fali ciągłej, takie jak lampy rtęciowe lub diody LED, które nie zapewniają dużej gęstości fotonów wymaganej do absorpcji dwóch fotonów. Dla efektywnego wzbudzenia dwufotonowego kluczowa jest moc i impulsowość źródła światła, a źródła światła w skanerach do przeźroczy nie są w stanie sprostać tym wymaganiom.
2. System detekcji
W obrazowaniu fluorescencji dwufotonowej często wykorzystuje się detektor niedeskanowany (NDD) do zbierania emitowanej fluorescencji. NDD może skuteczniej wykrywać sygnały fluorescencji, zwłaszcza w grubych próbkach, ponieważ nie ma na nią wpływu droga optyczna wiązki wzbudzającej. Natomiast fluorescencyjne skanery slajdów zazwyczaj wykorzystują system detekcji oparty na kamerze, który może nie być zoptymalizowany pod kątem obrazowania dwufotonowego. Czułość, liczba klatek na sekundę i zakres dynamiczny kamery mogą być również niewystarczające do przechwytywania słabych sygnałów fluorescencji dwufotonowej.
3. Mechanizm skanujący
Obrazowanie fluorescencyjne dwufotonowe zwykle polega na skanowaniu próbki punkt po punkcie za pomocą zwierciadła galwanometrycznego lub skanera rezonansowego. Pozwala to na szybkie i precyzyjne skanowanie wiązki laserowej w poprzek próbki. Z drugiej strony fluorescencyjne skanery slajdów zazwyczaj wykorzystują zmotoryzowany stolik do przesuwania slajdu względem nieruchomego układu optycznego. Szybkość i precyzja skanowania etapowego w skanerach slajdów mogą nie być odpowiednie w przypadku obrazowania dwufotonowego, zwłaszcza gdy wymagane jest obrazowanie z dużą szybkością lub monitorowanie w czasie rzeczywistym.
Istnieją jednak pewne wyjątki
Wraz z szybkim rozwojem technologii niektóre zaawansowane fluorescencyjne skanery slajdów mogą zostać zmodyfikowane lub zmodernizowane w celu uwzględnienia możliwości obrazowania dwufotonowego. Na przykład niektóre firmy badają zastosowanie laserów femtosekundowych w połączeniu ze skanerami slajdów, aby umożliwić obrazowanie dwufotonowe. Te systemy hybrydowe mogą oferować zalety zarówno wysokoprzepustowego skanowania slajdów, jak i głębokiego obrazowania dwufotonowego w tkankach.
Zastosowania i ograniczenia
Chociaż tradycyjnego skanera fluorescencyjnego do slajdów nie można bezpośrednio używać do obrazowania fluorescencyjnego dwufotonowego, obie techniki mają swoje własne, unikalne zastosowania:
Skanery slajdów fluorescencyjnych
Fluorescencyjne skanery slajdów idealnie nadają się do wysokowydajnego badania przesiewowego dużej liczby próbek. Są powszechnie stosowane w laboratoriach patologicznych do diagnozowania i badania chorób, takich jak rak. Skanery mogą szybko generować obrazy skrawków tkanek o wysokiej rozdzielczości, które można przechowywać cyfrowo w celu dalszej analizy i porównania.
Dwa – obrazowanie fluorescencji fotonowej
Obrazowanie fluorescencyjne dwufotonowe jest wykorzystywane głównie do obrazowania in vivo i ex vivo grubych próbek tkanek, takich jak wycinki mózgu, zarodki i żywe zwierzęta. Umożliwia badaczom badanie dynamicznych procesów zachodzących w komórkach i tkankach w ich naturalnym środowisku, takich jak aktywność neuronów, migracja komórek i angiogeneza.
Wniosek
Podsumowując, choć typowy fluorescencyjny skaner do slajdów nie jest przeznaczony do obrazowania fluorescencyjnego dwufotonowego ze względu na różnice w źródle światła, systemie detekcji i mechanizmie skanowania, istnieje potencjał do opracowania systemów hybrydowych, które połączą zalety obu technik. Jako dostawca fluorescencyjnych skanerów do slajdów dążymy do pozostania w czołówce innowacji technologicznych i odkrywania nowych możliwości dla naszych produktów.
Jeśli są Państwo zainteresowani naszymi fluorescencyjnymi skanerami slajdów lub mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące ich zastosowań, prosimy o kontakt w celu dalszej dyskusji i zakupu. Z niecierpliwością czekamy na współpracę z Tobą, aby spełnić Twoje potrzeby w zakresie obrazowania.
Referencje
- Denk, W., Strickler, JH i Webb, WW (1990). Skaningowa mikroskopia fluorescencyjna z laserem dwufotonowym. Nauka, 248(4951), 73-76.
- Tłok, DW i Sklar, Los Angeles (2008). Obrazowanie fluorescencyjne: od pojedynczych cząsteczek do technik makroskopowych. Prasa laboratoryjna Cold Spring Harbor.
- Pawley, JB (red.). (2006). Podręcznik biologicznej mikroskopii konfokalnej. Skoczek.
