Jeśli kiedykolwiek analizowałeś cyfrowe slajdy patologiczne lub próbki do badań obrazowych, prawdopodobnie zastanawiałeś się, w jaki sposób skaner slajdów mikroskopowych rejestruje każdy szczegół z taką precyzją — nawet jeśli szkiełko ma subtelne różnice w wysokości lub drobne niedoskonałości, które zakłócałyby ostrość standardowego aparatu. Jako dostawca wysokowydajnych cyfrowych skanerów do slajdów stale dostaję to pytanie i jest to jeden z najważniejszych czynników wpływających na to, dlaczego nasz sprzęt codziennie zapewnia niezawodne i spójne wyniki. Przyjrzyjmy się dokładnie, jak działa mechanizm ustawiania ostrości, dlaczego ma on znaczenie w różnych przypadkach użycia i w jaki sposób nasze skanery zostały zaprojektowane, aby wyróżniać się w tej dziedzinie.
Zacznijmy od podstaw: szkiełka mikroskopowe nie są idealnie płaskie. Standardowe szkiełko szklane ma grubość około 1 mm, ale umieszcza się na nim próbki biologiczne (takie jak skrawki tkanek, hodowle komórkowe lub preparaty cytologiczne), a ich wysokość może różnić się od 10 do 50 mikronów, a czasem więcej, w zależności od sposobu przygotowania próbki. Nawet drobny kurz lub inne zanieczyszczenia na szkiełku tworzą małe, nieoczekiwane warstwy. Aby skaner mógł uchwycić wyraźny obraz, jego ostrość musi regulować się w sposób ciągły podczas przesuwania się po slajdzie i musi to robić szybciej niż ludzkie oko jest w stanie mrugnąć, zachowując jednocześnie dokładność w granicach ułamka mikrona. To niemały wyczyn.
Większość skanerów slajdów mikroskopowych wykorzystuje jedną z dwóch podstawowych technologii ustawiania ostrości: pasywny autofokus (AF) lub aktywny AF, a wiele wysokiej klasy modeli łączy obie technologie, aby uzyskać to, co najlepsze z obu światów. Zacznijmy od pasywnego AF, ponieważ właśnie to wbudowaliśmy w nasze podstawowe skanery z jasnym polem, takie jak Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Pasywny AF nie emituje żadnego sygnału zewnętrznego; zamiast tego analizuje światło odbite od slajdu, aby określić, gdzie jest najostrzejszy obraz. Oprogramowanie systemu sprawdza kontrast obrazu w małych oknach, gdy skaner przesuwa obiektyw w górę i w dół. Gdy kontrast jest najwyższy, jest to punkt ostrości. W przypadku zastosowań w jasnym polu, gdzie próbki są barwione barwnikami tworzącymi wyraźne różnice między jasnością a ciemnością, sprawdza się to naprawdę dobrze. Jest wystarczająco szybki, aby skanować slajdy w jasnym polu przy powiększeniu 20x lub 40x, a także pozwala obniżyć koszty w laboratoriach, które nie potrzebują obrazowania fluorescencyjnego. Jednak pasywny AF ma swoje ograniczenia — jeśli slajd ma bardzo jednolity obszar o niskim kontraście (np. przezroczystą krawędź szkła lub cienką, niezabarwioną próbkę), oprogramowanie nie jest w stanie wykryć różnic w kontraście i ostrość może się wahać.
W tym miejscu pojawia się aktywny AF i właśnie tej technologii stawiamy na pierwszym miejscu w skanerach klasy badawczej, takich jak nasz fluorescencyjny skaner slajdów klasy badawczej. Aktywny AF wykorzystuje oddzielny czujnik lub źródło światła do rzutowania sygnału na szkiełko, a następnie mierzy, w jaki sposób sygnał ten odbija się z powrotem, aby obliczyć dokładną odległość od obiektywu do próbki. Dwa najpopularniejsze typy aktywnego AF stosowane w skanerach do slajdów to triangulacja laserowa i ogniskowanie oparte na aberracjach chromatycznych. Triangulacja laserowa jest prostsza: wiązka lasera podczerwonego o małej mocy jest skierowana na szkiełko, a czujnik kamery wykrywa, gdzie na szkiełku ląduje plamka lasera. Jeśli slajd jest za blisko lub za daleko, plamka przesuwa się na czujniku, a skaner dostosowuje położenie obiektywu, aby przywrócić plamkę do idealnego punktu. Działa to nawet w przypadku próbek o niskim kontraście, ponieważ mierzy odległość fizyczną, a nie kontrast świetlny. Ogniskowanie aberracji chromatycznej wykorzystuje źródło światła, które dzieli się na różne długości fal kolorów; każda długość fali skupia się w nieco innej odległości, więc skaner porównuje sposób, w jaki każdy kolor odbija się od slajdu, aby obliczyć ostrość. Jest to szczególnie przydatne w przypadku szkiełek fluorescencyjnych, które mogą mieć nawet niższy kontrast niż próbki w jasnym polu, ponieważ fluorofory raczej emitują światło niż je odbijają.
Wiele naszych skanerów, np. Digital Pathology Slide Scanner, wykorzystuje hybrydowy system AF, który łączy pasywny i aktywny AF w celu wyeliminowania martwych punktów. Oto jak to działa: kiedy skaner ładuje slajd po raz pierwszy, używa aktywnego AF do mapowania całego profilu wysokości slajdu w ciągu pierwszych 10 sekund. Tworzy to „mapę topograficzną” slajdu, zaznaczając każde wybrzuszenie, zagłębienie i zmianę. Następnie, gdy skaner przesuwa się po slajdzie i rejestruje obrazy, wykorzystuje pasywny AF, aby szybko dostosować ostrość do każdego pola widzenia, korzystając z fabrycznie załadowanej mapy tylko wtedy, gdy napotka obszary, w których pasywny AF miałby problemy. To hybrydowe podejście skraca czas skanowania, zapewniając jednocześnie, że nawet trudne próbki, takie jak zatopione w parafinie szkiełka tkanek o grubych, nierównych fragmentach, pozostaną ostre na całym obrazie.
Kolejną kluczową częścią mechanizmu ustawiania ostrości jest silnik piezoelektryczny, który faktycznie porusza obiektywem lub stolikiem w celu regulacji ostrości. Zamiast standardowych silników krokowych stosuje się silniki piezoelektryczne, ponieważ są szybsze i bardziej precyzyjne: mogą regulować pozycję w nanosekundach z dokładnością do 10 nanometrów, czyli znacznie mniejszą niż najmniejszy szczegół próbki tkanki. W przypadku skanowania z dużym powiększeniem (np. 60x lub 100x, co jest powszechne w patologii badawczej), precyzja ta nie podlega negocjacjom. Jeśli ostrość jest przesunięta choćby o 0,5 mikrona, obraz będzie rozmazany i przegapisz małe struktury, takie jak jądra czy markery białkowe. Nasz wielokanałowy skaner fluorescencyjny do slajdów wykorzystuje system silnika piezoelektrycznego, który może wykonać ponad 1000 regulacji ostrości na sekundę, co oznacza, że może skanować slajd z 40-krotną fluorescencją w czasie o połowę krótszym niż skaner z silnikiem krokowym, bez utraty ostrości.
Czekaj, ale co z przypadkami, w których próbki są grube? Niektóre próbki biologiczne, takie jak preparaty z całych organizmów lub hodowle komórkowe 3D, mają grubość kilkudziesięciu mikronów, więc nawet pojedyncza warstwa nie jest w stanie uchwycić wszystkich szczegółów. W tym miejscu pojawia się funkcja układania w Z naszych skanerów, która jest bezpośrednio powiązana z mechanizmem ustawiania ostrości. Zamiast skupiać się raz na pole widzenia, skaner rejestruje od 3 do 5 obrazów w różnych płaszczyznach ostrości, a następnie łączy je w celu utworzenia pojedynczego, ostrego obrazu obejmującego każdą warstwę próbki. W zastosowaniach badawczych jest to niezbędne do badania struktury 3D tkanek lub kolokalizacji wielu markerów fluorescencyjnych. Nasz cyfrowy skaner patologiczny GScan-60 jest wyposażony w tryb układania w stos, który reguluje ostrość w krokach co 2 mikrony, dzięki czemu nie umknie żaden szczegół w grubych próbkach klinicznych.
Widziałem na własne oczy, jak słaba koncentracja może zakłócić prace badawcze lub diagnostyczne w laboratorium. Mój kolega z małego laboratorium patologicznego powiedział mi kiedyś, że używają tańszego skanera do slajdów, który traci ostrość na krawędziach slajdów, co zmusza patologów do ręcznej korekty 20% obrazów. To marnowało wiele godzin i prowadziło do opóźnień w diagnozowaniu pacjentów. Po przejściu na nasze skanery hybrydowy system AF ograniczył ręczne korekty do mniej niż 1%, a czas skanowania skrócił się o 30%. Na tym właśnie polega prawdziwa wartość dobrze zaprojektowanego mechanizmu ustawiania ostrości – nie chodzi tylko o uzyskanie wyraźnego obrazu; chodzi o oszczędność czasu, ograniczenie błędów ludzkich i umożliwienie dokładniejszych wyników.
Istnieje kilka powszechnych mitów na temat ustawiania ostrości skanera do slajdów, które również chcę rozwiać. Niektórzy uważają, że większe powiększenie oznacza, że potrzebny jest bardziej skomplikowany system ustawiania ostrości, ale tu mniej chodzi o powiększenie, a bardziej o rodzaj próbki. Na przykład szkiełko z 40-krotnym jasnym polem zawierającej wybarwioną próbkę tkanki wymaga precyzyjnej ostrości, ale 20-krotne szkiełko hodowli komórkowych na płaskim szkiełku może dobrze działać z pasywnym AF. Inne mity: aktywny AF jest zawsze wolniejszy niż pasywny AF. Dzięki nowoczesnym silnikom piezoelektrycznym aktywny AF jest w rzeczywistości szybszy, ponieważ nie musi skanować wielu pozycji, aby znaleźć najostrzejszy kontrast – bezpośrednio oblicza odległość.
Kolejnym ważnym czynnikiem wpływającym na ostrość jest kalibracja. Nawet najlepszy mechanizm ustawiania ostrości nie będzie działał, jeśli nie będzie regularnie kalibrowany. Nasze skanery są wyposażone w procedury automatycznej kalibracji uruchamiane za każdym razem, gdy ładujesz slajd nowego typu, a w razie potrzeby udostępniamy instrukcje krok po kroku dotyczące ręcznej kalibracji. Do każdego skanera dołączamy również slajdy testowe, dzięki czemu laboratoria mogą sprawdzić, czy ostrość jest dokładna. W przypadku badań, gdzie kluczowa jest spójność między eksperymentami, ta kalibracja gwarantuje, że obrazy z różnych skanów będą porównywalne, nawet w odstępie kilku miesięcy.
Porozmawiajmy teraz o tym, jak projektujemy nasze mechanizmy ogniskowania, aby dopasować je do różnych potrzeb klientów. Laboratorium badawcze skanujące slajdy fluorescencyjne potrzebuje systemu skupiającego, który może obsłużyć wiele fluoroforów, które mogą mieć różne długości fal emisji. Nasz fluorescencyjny skaner slajdów klasy badawczej został zaprojektowany z czujnikiem uwzględniającym różne długości fal światła, dzięki czemu ostrość pozostaje stała niezależnie od tego, czy skanujesz kanały DAPI (niebieski), FITC (zielony) czy Texas Red (czerwony). W przypadku cyfrowych laboratoriów patologicznych, które przetwarzają setki slajdów dziennie, szybkość ma kluczowe znaczenie — hybrydowy system AF naszego GScan-60 może zeskanować cały slajd w mniej niż 5 minut, a mechanizm ustawiania ostrości nie staje się mniej precyzyjny po tysiącach skanów, ponieważ używamy trwałych komponentów klasy przemysłowej.
Klienci pytali mnie również o skupienie się na mokrych preparatach, np. preparatach do obrazowania żywych komórek. Nasze skanery radzą sobie z mokrymi slajdami, ale zalecamy korzystanie z aktywnego trybu AF, ponieważ mokre próbki mogą mieć odbicia powierzchniowe, które mylą pasywny AF. Aktywny AF oparty na laserze może penetrować cienką warstwę cieczy na szkiełku, aby skupić się na samej próbce, co jest dużą zaletą dla laboratoriów wykonujących obrazowanie poklatkowe hodowli komórkowych.
Ostatecznie mechanizm ustawiania ostrości jest niedocenianym bohaterem skanera szkiełek mikroskopowych. Jest to część, która działa za kulisami i zamienia rozmazane szkiełko w wyraźny, szczegółowy obraz cyfrowy, który badacze mogą analizować, patolodzy mogą wykorzystywać do stawiania diagnoz, a klinicyści mogą polegać na planach leczenia. Niezależnie od tego, czy prowadzisz małe laboratorium diagnostyczne, uniwersyteckie laboratorium badawcze, czy firmę farmaceutyczną testującą nowe leki, niezawodny system ogniskowania nie jest luksusem – jest koniecznością.
Jeśli szukasz skanera do szkiełek mikroskopowych i chcesz dowiedzieć się więcej o tym, w jaki sposób nasza technologia ogniskowania może spełnić Twoje potrzeby, nasz zespół jest tutaj, aby Ci pomóc. Od skanerów jasnego pola do rutynowej diagnostyki po skanery fluorescencyjne klasy badawczej do zaawansowanego obrazowania – możemy przeprowadzić Cię przez funkcje, które są najważniejsze w Twojej pracy. Niezależnie od tego, czy interesuje Cię skaner EScan-1200 do laboratorium patologicznego, GScan-60 do wysokowydajnego skanowania, czy nasze wielokanałowe skanery fluorescencyjne do badań, jesteśmy gotowi omówić, w jaki sposób nasz sprzęt może usprawnić przepływ pracy i poprawić wyniki.
Referencje
- Agrawal, M. i Gupta, R. (2021). Technologie autofokusa dla cyfrowych skanerów slajdów do patologii: analiza porównawcza. Journal of Pathology Informatics, 12 (1), 45–52.
- Liu, Y. i in. (2020). Mechanizmy ogniskowania o wysokiej precyzji dla systemów obrazowania całych slajdów. Transakcje IEEE dotyczące obrazowania medycznego, 39(8), 2678-2687.
- Światowa Organizacja Zdrowia. (2019). Patologia cyfrowa w zastosowaniach diagnostycznych i badawczych: specyfikacje techniczne i najlepsze praktyki. WHO Press, Genewa.
